Compréhension des biais d'assemblage

Lorsque l'on effectue un assemblage de novo genome guided avec un outil comme StringTie, il arrive que les résultats ne correspondent pas entièrement aux attentes biologiques.

Lors d'une analyse de transcrits issus d’un assemblage, nous avons pu observer que tous les transcrits obtenus correspondaient à une fusion de deux gènes (shble et eGFP) même si le niveau de couverture entre ceux-ci était très inégal. En effet, la couverture de shble était nettement plus élevée que celle de eGFP.

Qu'est-ce qui peut expliquer qu'aucun transcrit shble seul n'a été identifié, malgré sa forte couverture ?

Pourquoi StringTie fusionne-t-il ces transcrits ?

Un modèle de transcription basé sur la continuité

StringTie en genome guided utilise les alignements des lectures pour reconstruire les transcrits en favorisant les connexions entre régions. shble et eGFP étant exprimés à partir d'un même locus, car sur un plasmide, StringTie peut supposer qu’ils forment un seul transcrit. Cela reste vrai même si la couverture entre ces régions est inégale. La présence de lectures chevauchant les deux gènes contribue à cette fusion.

Faible couverture de eGFP

Bien que la couverture de eGFP soit faible, elle semble suffisante pour établir un lien avec shble. StringTie ne discrimine pas les régions à faible couverture si elles sont reliées par des lectures contiguës. Ainsi, tant qu’une continuité existe dans les alignements, StringTie préférera reconstruire un transcrit complet plutôt que de séparer les régions.

Paramètres de StringTie

StringTie offre de nombreux paramètres configurables, mais certains d'entre eux peuvent accentuer le problème :

• -f : ce paramètre contrôle la proportion minimale d'expression requise pour qu'un isoforme soit reporté. Une valeur élevée peut favoriser les transcrits dominants (comme shble-eGFP) et exclure des formes minoritaires (comme shble seul)
• --rf / --fr : ces paramètres permettent de renseigner le strandedness de la librairie. Un mauvais choix peut favoriser des défauts d'assemblage

-f <0.0-1.0>    Sets the minimum isoform abundance of the predicted transcripts as a fraction of the most abundant transcript assembled at a given locus. Lower abundance transcripts are often artifacts of incompletely spliced precursors of processed transcripts. Default: 0.01

--rf    Assumes a stranded library fr-firststrand.

--fr    Assumes a stranded library fr-secondstrand. 

Comment explorer et résoudre ce problème ?

Visualisation des alignements

L’analyse visuelle des alignements est un premier pas crucial. Les outils comme IGV permettent d’observer si des lectures couvrent uniquement shble ou si elles sont toujours connectées à eGFP. Cela permet aussi d’évaluer si les régions à faible couverture de eGFP influencent l’assemblage.

Ajustement des paramètres StringTie

Les paramètres de StringTie cités plus haut peuvent être modifiés pour explorer d'autres hypothèses :

• réduire -f pour inclure des isoformes minoritaires (même si déjà très faible)
• s'assurer que le strandedness est renseigné correctement

Assembler différemment

En complément de StringTie, il peut être utile d'utiliser d’autres outils comme Trinity pour assembler les transcrits. Ces outils ont des algorithmes différents et pourraient révéler des transcrits absents dans les résultats de StringTie.

L'impact de la biologie

Il est important de se demander si l'absence de transcrits shble seul est une limite technique ou une réalité biologique. Dans certains systèmes, notamment avec des constructions artificielles comme des plasmides, tous les transcrits peuvent naturellement être co-transcrits. Si tel est le cas, il n’y aura biologiquement aucun shble isolé même si la couverture suggère qu’il pourrait exister. C'est là où il est intéressant de compléter la bioinformatique par la paillasse.